El laboratorio de parasitologia

domingo, 20 de octubre de 2013

Examen Coproparasitario

MÉTODO EN FRESCO PARA TRICHOMONAS VAGINALIS

Introducción es un método sencillo en que se utiliza la secreción vaginal para la observación del protozoario; trichomonas vaginalis. La tricomoniasis urogenital es causada en el ser humano por el protozoario trichomona vaginalis. Aunque se transmite por contacto sexual no se a descartado que se transmite raramente por fómites.

El parasito se localiza en el tracto genital y urinario de la mujer o del hombre, en donde puede causar vaginitis o uretritis. La tricomoniasis es la enfermedad también de transmisión sexual no viral más importante en el mundo.

La tricomonas pueden presentar forma piriforme, ameboide, esferoidal, elipsoidal, u ovoidal, asociándose la forma ameboide con la expreccion de la virulencia del paracito. A nivel nacional, la tricomoniasis a ocupado un lugar preponderante en las primeras causas de movilidad.

El diagnostico de la tricomoniasis en la mujer se realiza por examen directo en fresco y en en fresco de la secreción vaginal observada en el microscopio obtenida de los fondos del saco vaginal lateral y posterior. En el hombre, la infección usualmente es asintomática y el examen debe realizarse de la secreción obtenida por la mañana antes de la primera mixion. La identificación y diagnostico de las tricomonas se realiza por medio del análisis microscópico, identificando las formas móviles del parasito

MATERIAL Y REACTIVOS:

· Solución salina

· Porta objetos

· Cubre objetos

· Guantes

· Espejo vaginal

· Tubo de ensayo

· Pipetas graduadas

· Mesa ginecológica

· Gradilla

· Cubre boca

· Microscopio

TÉCNICA:

· Preparar los materiales para la toma de muestra.

· Acomodar a la paciente en posición ginecológica.

· Introducir el hisopo (estéril en la cavidad vaginal de la paciente).

· Depositar el hisopo en un tubo que contenga un mililitro de solución salina.

· Mezclarlo y tomar una gota de esa solución.

· Depositarla en un portaobjeto

· Colocar el cubre objeto sobre la muestra.

· Observar al microscopio con objetivo de 40

MÉTODO COPROPARASITOSCÓPICO DE STOLL

I N T R O D UCCION: Norman Rudolph Stoll uno de los fundadores de la Parasitología, llevo a cabo una investigación sobre Parasitología en todo el mundo, relacionada con aspectos epidemiológicos de infecciones por uncinarias.(l)

En 1923, propuso un método sencillo para contar huevos de uncinarias en la materia fecal y además demostró que existe una relación aproximada entre el número de huevos excretados y el número de uncinarias adultas alojadas en el intestino.(1). Stoll desarrolló éste método cuantitativo para el conteo de huevos teniéndose con ello un avance en el diagnóstico y empezó a conocerse su método en todo el mundo como “técnica para el conteo de huevos por dilución de Stoll”.

MATERIAL:

- Probetas graduadas de 100 ml con tapón esmerilado o tubos de ensaye graduados con tapón de hule.

- Pipetas de Stoll o pipetas graduadas de 2 ml en 0.01 ml

- Portaobjetos de 74 X 38 mm

- Cubreobjetos de 22 X 40 mm

- Varillas de vidrio de 20 cm de longitud o abatelenguas

- Perlas de vidrio de 5 mm de diámetro.

- Gradillas para los tubos

REACTIVOS: , ; .

- Hidróxido de sodio 0.1 N. , 19

- Agua destilada.

E Q U I P O:

- Microscopio compuesto.

MATERIAL BIOLÓGICO:

-Muestra de materia fecal positiva a huevos de helmintos (una muestra).

TÉCNICA:

- Colocar en la probeta hidróxido de sodio 0.1 N. hasta la marca de 56 ml o 14 ml si se realiza el método modificado en tubo de ensayo.

- Con la varilla de vidrio se añade materia fecal hasta que suba el nivel a 60 ml en la probeta o a 15 ml en el tubo de ensayo según sea el caso.

- Si las heces son duras, se espera unos 5 minutos hasta que se reblandezcan.

- Se añaden de 8-12 perlas de vidrio, se tapa la probeta o el tubo de ensayo (con el tapón de hule)

- Se agita fuertemente de arriba a abajo durante un minuto, hasta obtener una suspensión homogénea.

- Los huevos y restos empiezan a precipitar en cuanto cesa la agitación.

- Con una pipeta de Stoll o equivalente, tomar inmediatamente 0.15 o 0.075 ml de la suspensión, llevando la punta de la pipeta al centro de la probeta ó del tubo. El error debido a la precipitación de los huevos disminuye con éste procedimiento.

- Se pasa la totalidad de la muestra tomada a un portaobjetos y se coloca un cubreobjetos.

- Se examina la preparación sistemáticamente al microscopio con objetivo seco débil y se cuentan todos los huevos y larvas presentes, cuidando de no contar dos veces la misma estructura.

DESARROLLO DE LA_ PRÁTICA:

1.-Realizar primero el examen físico de la materia fecal, para determinar la

consistencia de la misma.

2.-Practicar la técnica de dilución de Stoll y observar al microscopio las

Preparaciones con el objetivo seco débil.

3.-Identificar los huevecillos encontrados en la muestra y hacer el conteo por

separado para cada especie de helminto.

4.- Aplicar el factor correspondiente y reportar en h ml h.

MÉTODO DE SEDIMENTACIÓN SIMPLE EN COPAS

FUNDAMENTO: Este procedimiento de decantación en copas es una técnica farmacéutica conocida desde muchos años en el cual se utiliza un procedimiento físico para la separación de mezclas.

Este método también es utilizado para el diagnostico de aquellas muestra de heces fecales sospechosas de contener huevos de Fasciola hepatica; el método ha demostrado ser bondadoso para otro tipo de huevos de helmintos e incluso para quistes de protozoario. Las ventajas que tiene, sobre otro, es que hace una concentración de volúmenes considerablemente grandes de materia fecal.

MATERIAL

Reactivos

-Verde de malaquita

-Detergente

-Agua de la llave ó Agua destilada

Soluciones

Solución de detergente al 5% ( Se pasan 5 g de detergente de cualquier marca y se disuelve en 1000 ml de agua; el detergente que no se alcance a disolver, se sedimenta y decanta el sobrenadante o se deja en el frasco donde se guarda la solución, pues no interfiere en el proceso)

Solución de verde de malaquita al 1% ( Se disuelve el verde de malaquita en los 100 ml de agua y se guarda la solución en frascos con tapón esmerilado).

Vidriería

-Copas crónica

-Pipeta pasteur

-Portaobjetos

-Cubreobjetos.

-Embudo

Aparatos

Microscopio compuesto

Otros

Aplicadores de madera

Bulbos de caucho

Gasa

METODO

1. En el recipiente donde se llevo la muestra al laboratorio se homogeneiza la muestra con agua de la llave y se hace pasar a través de la gasa previamente colocada en un embudo y recibiendo la suspensión en la copa.

2. Se colocan 5 ml de colorante y se agita con un aplicador

3. Se agregan 5 ml de la solución de detergente y se agita nuevamente

4. Se completa el volumen de la copa y se deja reposar durante 15 min.

5. Se decanta el sobrenadante y se agrega mas agua, mezclando con el aplicador y se deja reposar otros 15 min.

6. Se decanta nuevamente el sobrenadante.

7. Con la pipeta con bulbo, se toma del sedimento la muestra que se coloca en el portaobjetos y se pone el cubreobjetos.

8. Se observa con el microscopio, usando objetivos de 10X y 40X, cuando sea necesario.

9. Se hacen tres preparaciones de cada sedimento para asegurar la positividad de la muestra. Cuando se tiene suficiente practica se puede utilizar la lupa del microscopio, sobre todo cundo se busca la F. hepatica.

MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR SEDIMENTACIÓN RITCHIE

GENERALIDADES: En 1917 Carles y Barthelemy describieron el primer método de concentración por sedimentación utilizando solución salina, éter y formaldehído, años más tarde, en 1948 Ritchie describió un método semejante, el cual hasta la fecha se sigue utilizando. En evaluaciones comparativas con este método, se ha demostrado su utilidad para el diagnóstico de parasitosis intestinales leves o moderadas.

El empleo de éter y formaldehído, permite con el primero, liberar las formas parasitarias de las grasas, por disolución de las mismas y con el formol se fijan y conservan. La concentración se hace por centrifugaciones sucesivas. Unas ventajas que tiene este método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

MATERIAL Y EQUIPO

· Microscopio

· Centrífuga

· Tubos de ensaye cónicos de 15 ml

· Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado

· Embudos de polietileno

· Vasos de precipitado de 50 ml

· Aplicadores de madera

· Pipetas Pasteur con bulbo

· Portaobjetos de 26 X 76 mm

· Cubreobjetos de 22 X 22 mm

· Solución salina isotónica

· Solución de formaldehído al 10%

· Éter etílico comercial

METODO

1.- Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. de la materia fecal en el vaso de precipitado, se añaden 10 ml de solución salina y se homogeniza.

2.- Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico.

3.- Se centrífuga la suspensión durante 1 min a 2000 rpm.

4.- Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo las veces necesarias hasta que el sobrenadante sea claro.

5.- Al último sedimento se agregan 10 ml de solución de formaldehído al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 min.

6.- Se añaden después 5 ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos.

7.- Se centrífuga durante 2 minutos a 1500 rpm.

8.- Después de centrifugar se observan 4 capas:

a) éter en la superficial,

b) un tapón de restos fecales,

c) formaldehído,

d) sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.

9.- Se introduce la pipeta Pasteur hasta la capa d, se extrae con cuidado una gota del sedimento y se coloca en un portaobjetos.

10.-Se le añade una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos, se homogeniza, cubriéndolo con el mismo.

11.-Se observa la preparación en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

12.-Se anotan resultados de observación y hacer dibujos.

MÉTODO COPROPARASITOSCÓPICO DE " K A T O ".

OBJETIVOS:

1.- Aprender a realizar un método coproparasitoscópico cuantitativo de frotis grueso por la técnica de Kato.

2.- Identificar y cuantificar el número de huevecillos de helmintos por gramo de heces.

3.- Conocer las ventajas y desventajas del método

I N T R O D U C C I Ó N:

En 1954 Kato y Miura Introdujeron la técnica de estudio del "frotis grueso" con buen resultado para contar huevos de helmintos. Martín y Beaver en 1968 desarrollaron modificaciones a ésta técnica que les permitió retirar fibras de la materia fecal,hacer extensión uniforme del frotis y evitar aclaraciones excesivas de la preparación. Para el diagnóstico de las infecciones por SCHISTOSOMA MANSONI y SCHISTOSOMA HEMATOBIUM la técnica que se usa es la del frotis grueso de Kato. Aunque no es escencial para hacer estimaciones fiables de la producción de huevos. Kato y colaboradores recomendaron una modificación que consiste en el empleo de un patrón calibrador, fabricado de cartón o plástico desechables, de un grosor tal que contenga aproximadamente 50 mg. de heces fecales. Tras presionar la muestra fecal en el orificio, sujetando éste en el centro del portaobjetos, se retira y se desecha el patrón, se extiende la muestra bajo una lámina de celofán y se efectúa el recuento de huevos con la técnica habitual. Peters y colaboradores introdujeron y probaron otra modificación denominada "Frotis rápido de Kato’’. Una dificultad que plantea el empleo de patrones es que pueden quedar atrapadas burbujas de aire en la muestra medida y que una gran parte de ésta puede adherirse al patrón.

F U N D A M E N T 0:

El fundamento de esta técnica se basa en la acción que tiene la glicerina como aclarador de los huevos de helmintos y el verde de malaquita como colorante de contraste.

M AT E R I A L Y R E A C T I V O S:

- Solución de glicerina-verde de malaquita. En ésta solución se sumergen los cubreobjetos de celofán por un mínimo de 24 hr. antes de usarlos (Aunque el verde de malaquita reduce la potencia ocular del microscopio, pero no interfiere en la identificación de los huevecillos).

- Cubreobjetos de papel celofán (no adherible) de grosor medio cortados en rectángulos de 22 X 40 mm

- Malla de acero inoxidable de trama 105 cortada en cuadros de 4 cm de lado. También puede utilizarse una malla de fibra sintética gruesa y de trama similar.

- Portaobjetos de 38 X 76 o de 26 X 76 mm

- Aplicadores de madera,

EQUIPO:

-Microscopio compuesto.

-Balanza analítica.

MATERIAL BIOLÓGICO:

- Una muestra de materia fecal positiva a huevos de helmintos.

TÉCNICA:

1.-Con un aplicador de madera se transfieren aproximadamente 50 mg. de heces a un portaobjetos (un cubo de 4 mm. de heces pesa aproximadamente. 65 mg.). Cuando se trata de muestras fibrosas se ponen unos 2 gr. de heces en una hoja de papel desechable, se coloca sobre las heces un cuadro de malla y se presiona, se retira una muestra de las heces coladas con un aplicador de madera haciendo un raspado. Cuando las heces son compactas y duras hay que añadir algunas gotas de agua hasta conseguir una consistencia pastosa ó pulposa.

2.-Se pesa una muestra fecal de 50 mg y se cubre con un cubreobjetos de celofán

humedecido previamente en la solución de glicerina-verde de malaquita, se pone la 25 preparación boca abajo en una superficie absorbente plana, por ejemplo un papel grueso y blando, sobre una mesa, y se presiona hasta que la película fecal cubra una área de 20-25 mm de diámetro. Cuando la cantidad de heces situadas sobre el portaobjetos sea excesivo (suele fluir por debajo del cubreobjetos) se desecha con el papel absorbente.

3.-Se deja en reposo la preparación durante alrededor de 1 hr a temperatura ambiente con una humedad relativa moderada o durante 20-30 min. En Incubadora seca a 37º C. De ésta forma, los huevos se transparentan, y las larvas no se pueden observar. Como con ésta técnica los huevos de uncinarias y algunas otras especies que tienen la pared muy delicada se colapsan y desaparecen, la preparación debe examinarse inmediatamente después de la incubación, para que el aclarado no sea excesivo, además el procedimiento de secado puede interrumpirse temporalmente poniendo la preparación boca abajo sobre una superficie plana y lisa.

4.-Se examina toda la preparación a seco débil, cambiando a seco fuerte para identificar a los Huevecillos.

D E S A R R 0 L LO D E L A P R Á C T I C A:

a).-Realizar primero el examen físico de las heces para determinar la consistencia.

b).-Realizar la técnica de Kato y observar al microscopio las preparaciones.

c).-Identifique los parásitos encontrados en la muestra.

d).-Realice el conteo de huevecillos observados en toda la preparación, si hay más de una especie el conteo debe hacerse por separado al igual que los cálculos.

METODO DE GRAHAM

GENERALIDADES: técnica basada en que la hembra adulta de Enterobius vermicularis no deposita sus huevos en el interior del intestino, sino que por lo general emigra durante la noche, hacia las márgenes del ano, depositando los huevos en los pliegues perianales. Es por esto que la toma debe efectuarse en la mañana indicando que debe ir a defecar y no debe bañarse.

Ocasionalmente se pueden encontrar huevos de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Hymenolepis nana, Taenia sp.

MATERIAL Y EQUIPO

· Portaobjetos De 26 X 76 mm

· Abatelenguas

· Cinta de celulosa Scotch

· Microscopio

METODO

1.- Sobre un extremo del abatelenguas se coloca la cinta Scotch con la parte adherente hacia fuera, sujetándola con los dedos pulgar e índice.

2.- Se presiona la superficie sobre la región perianal hacia uno y otro lado, finalmente se hace un frote perianal.

3.- Separar cuidadosamente la cinta del abatelenguas y adherirlo sobre un portaobjetos .

4.- Observar con objetivo de 10X.